供稿人：彭思琦、孙畅宁 供稿单位：西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室 发布日期：2024-04-17
骨肉瘤是一种常见的原发性恶性骨肿瘤，主要影响儿童和青少年，由于其高度侵袭性和转移性，骨肉瘤显著影响患者的生活质量和总生存期，目前骨肉瘤术后解剖重建和肿瘤切除后局部复发的预防是骨肉瘤治疗的两个重要临床挑战。因此，开发能够修复严重的骨缺损，并防止肿瘤复发新型功能化支架材料已成为当前急需解决的问题。目前，3D打印钛合金是一种公认的具有更有效果的支架，因为其弹性模型更接近皮质骨，与宿主骨的接触面积更大，形状设计更灵活，应力屏蔽和对宿主骨的压力更小（脊柱终板塌陷率更低），更适合大跨度、长节段、不对称骨缺损的修复。然而，由于骨肿瘤患者接受3D打印钛合金治疗的预期寿命延长，许多问题仍有待解决，例如疲劳断裂和局部肿瘤复发的风险增加。因此，使其具有成骨和抗肿瘤特性是当务之急。
最近发现辛伐他汀在骨生成和抗菌作用中发挥关键作用，是治疗骨肉瘤相关骨缺损的理想药物。PLGA-PEG-PLGA水凝胶是一种常用的药物载体，它也是一种可逆的热敏性凝胶化，便于处理和易于应用。然而，其力学强度不足以用作骨替代物。北京大学第三医院骨科的景泽浩医生开发了一种辛伐他汀/水凝胶负载的3D打印钛合金支架，评估其对兔髁突骨缺损模型和荷骨肉瘤裸鼠模型的成骨和骨肉瘤的影响。
本研究首先进行3D打印钛合金支架的制备，使用电子束熔化（EBM）S12系统进行制备钛合金支架，直径5 mm × L 6 mm，孔径640 μm，支柱直径400 μm，并进行辛伐他汀和水凝胶的搭载，分别制备了辛伐他汀最终浓度分别为0.5、1、1.25、2.5、5、10、15和20 mg/mL的支架Sim-3DTi。通过场发射电镜（SEM）、能量色散光谱（EDS）等方式对于制备获得的支架进行了表征，并测定了其弹性模量和粘性模量。本研究中3DTi的物理参数证明3DTi的力学性能符合骨植入物的要求；在SEM图像中，Sim-3DTi是一个实心圆柱体，由具有大孔金刚石晶格结构的3DTi、具有微孔结构的水凝胶和长度约为5-10 μm的棒状辛伐他汀颗粒组成，3DTi的大孔可以容纳水凝胶，水凝胶的微孔可以容纳辛伐他汀颗粒，从而使Sim-3DTi成为稳定的复合物；EDS分析揭示了碳和氧在Sim-3DTi表面上的元素富集，与钛、铝和钒的元素富集不同，进一步验证了3DTi和水凝胶的元素组成及其在Sim-3DTi中的紧密结合。
图1 Sim-3Dti的制备与表征。(A)Sim-3DTi构建方案示意图；(B)Sim-3DTi、3DTi、PLGA-PEG-PLGA水凝胶和辛伐他汀颗粒的代表性SEM图像；(C)Sim-3DTi的代表性EDS分层图像和定量元素分析
接下来进行生物性能测试，首先进行Sim-3DTi体外抗骨肉瘤作用及生物安全性研究，通过进行细胞数量测定、细胞活力评定、细胞染色观察等方式对细胞增殖、生长、分化、存活率进行评估进而对Sim-3DTi支架的体外生物性能进行评估。实验结果显示辛伐他汀负荷存在最佳剂量范围（2.5-5 mg/ mL），其可以降低骨肉瘤细胞的生存力，而不降低健康细胞的生存力。
图2 Sim-3DTi生物安全性和体外抗骨肉瘤作用的辛伐他汀浓度筛选。(A) Sim-3DTi最佳辛伐他汀浓度生物安全性和抗骨肉瘤作用示意图。(B-E)在与Sim-3DTi共培养后第1、5天L929和143 B细胞的细胞活力
接下来进行Sim-3DTi体内抗骨肉瘤作用及生物安全性研究，选用移植有肿瘤的大鼠作为动物实验模型，将支架皮下放置在每只小鼠的肿瘤附近，其中，植入3DTi的小鼠定义为对照组，而植入负载2.5 mg/mL和5 mg/mL辛伐他汀的Sim-3DTi的小鼠分别定义为Sim 2.5和Sim 5组。实验结果显示随着Sim 3DTi中辛伐他汀负荷的增加，肿瘤体积显著减小，且Sim 5具有更强的抑瘤作用。此外，在任何组中均未观察到细胞变性或坏死。这些结果表明，Sim-3DTi可以发挥抗骨肉瘤作用，同时保持生物安全性。
另外同时进行体内成骨作用，选用新西兰白色家兔，在股骨外侧髁上创建直径5 mm、深6 mm的圆柱形缺损，最终通过显微计算机断层扫描（micro-CT）成像、不脱钙组织切片和BMP-2检测骨生长情况。Micro-CT重建和切片显示骨生成直接在植入物中和周围，辛伐他汀负荷组种植体内及周围的骨生成显著增加。两个指标（BV/TV，与成骨呈正相关，Tb.SP，与成骨呈负相关），使用micro-CT成像定量分析成骨。BV/TV值从Sim 5组到Sim 2.5组再到对照组呈下降趋势，Tb.Sp则相反，表明辛伐他汀负荷促进体内骨生成；使用进行Masson Goldner三色染色的未脱钙切片来评价Sim-3DTi在体内的骨内生长和骨整合，随着辛伐他汀的负载量从对照组增加到Sim 2.5和Sim 5组，连接到3DTi支柱的孔中的矿化骨的量显著增加。同时，骨向内生长和骨整合的程度也逐渐增强，证明了通过3DTi将辛伐他汀局部递送到骨缺损的成骨作用。这些结果与micro-CT成像结果一致。
图3 Sim-3DTi的体内成骨作用。(A)使用显微CT成像对ROI中的骨和植入物进行重建（顶线）和切片（底线）。骨和植入物在顶行中分别为黄色和银，而在底行中分别为灰色和白色。通过两个指标量化ROI中的骨生成：（B）骨体积/组织体积（BV/TV）和（C）骨小梁分离（Tb.Sp）
在本研究中使用温度敏感的PLGA-PEG-PLGA水凝胶将辛伐他汀负载到3DTi中，从而构建辛伐他汀/水凝胶负载复合物，通过不同浓度的Sim-3DTi与L929和143 B细胞共培养，发现Sim-3DTi有一个合理的浓度（2.5-5 mg/mL），以达到最佳的生物安全性和抗骨肉瘤作用。在兔髁状突骨缺损模型和裸鼠骨肉瘤模型中，Sim-3DTi配合合理浓度的辛伐他汀能够上调BMP-2的表达，促进成骨，抑制骨肉瘤的发生，同时保证良好的生物安全性。由于Sim-3DTi结构简单，生物安全性好，具有明显的成骨活性和抗骨肉瘤活性，因此它应该是一种有前途的骨替代材料，用于修复骨肉瘤相关的严重骨缺损。