供稿人：白路歌、王玲 供稿单位：西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室 发布日期：2024-03-21
比起目前常用的2D神经细胞培养，3D神经组织培养包含大量的物理和化学线索，为正常和病理情况下神经元信号传导和神经网络功能的相关研究提供了更有效的模型。已有大量研究使用生物打印方法制造体外3D神经组织，但这些研究多使用模具辅助成形，缺乏适合神经组织的通用生物墨水和生物打印方法，难以制造具有高度时空可控性的神经网络结构。
为了解决此问题，来自澳大利亚莫纳什大学的Helena C. Parkington团队开发了低浓度明胶-降冰片烯聚(乙二醇)-二巯基生物墨水，使用大鼠初级皮层神经元和星形胶质细胞，生物打印了包含灰质和白质在内的类脑三维神经结构，并研究其网络形成和功能。
如图1所示，研究者使用含细胞生物墨水打印“细胞链”（绿色）模拟大脑灰质，使用不含细胞墨水打印“脱细胞链”（灰色）模拟大脑白质，交替打印“细胞链”和“非细胞链”模拟大脑层级结构，并设计了两种交替结构A（图1A）和B（图1B）。培养7天之后，“细胞链”内的神经元胞体形成大的球形簇，类似于富含神经元的大脑灰质；“脱细胞链”内不含胞体但含有大量神经突，模拟了富含神经突的大脑白质；各“细胞链”之间通过建立跨“脱细胞链”的突触连接形成了广泛的神经网络。结果发现，“细胞链”之间轴突的生长模式似乎受到“细胞链”和“脱细胞链”的接近程度和相对排列的影响。在结构A中神经突选择了阻力较小的路径，即优先沿“脱细胞链”表面生长，在结构B中神经突选择了最短路径，即穿过中间的“脱细胞链”区域进行连接。
图1生物打印皮层结构设计及培养7天后的免疫荧光染色图像。（标尺：100 μm）
研究者通过钙成像和电信号记录进一步探索了打印得到的神经网络的功能。细胞钙成像显示在体外培养14天（图2A, C）和21天（图2B, D）之后，神经组织出现有节律、准同步的自发钙振荡。电信号结果表明（图3），当一个“细胞链”的神经元受到电刺激时，远处另一“细胞链”的神经元产生相应的电活动。这些结果表明，所构建的体外神经网络的神经元群之间形成了跨越“脱细胞链”空间的功能连接。
图2 体外培养14天和21天之后细胞钙成像结果
图3 体外培养12 后电刺激下“细胞链”间功能电生理。（标尺：200 μm）
综上所述，这项研究报告了一种生物打印方法，可以高分辨率和高通量地制造具备复杂结构的软性独立神经结构，且形成了自发的、刺激响应的、功能性的3D神经元网络，探讨了生物打印如何影响神经网络的形成和神经元的功能，为理解神经网络的基本问题、工程神经形态电路和体外药物筛选提供了潜在平台。