供稿人：张源、高琳 供稿单位：西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室 发布日期：2024-01-19
心肌组织工程已成为治疗心肌梗塞的一种有前途的治疗策略。许多研究表明，结合干细胞、生物材料和生物工程的细胞化心脏补片/结构可以防止梗死后重塑并修复受损的心肌，且具有各向异性肌纤维和血管化特征的心脏补片在动物体内可以有效增加细胞移植和物质供应。但挤出打印难以独立实现组织构建物的分层多尺度微制造，因此制造出具有各向异性肌纤维和可灌注的血管通道的厚心肌组织仍然是一个重大挑战。
近日，重庆大学的研究团队报告了一种利用定制光束扫描立体光刻打印技术（SL）和开发的脱细胞外基质微纤维增强明胶基生物墨水，制造具有各向异性肌纤维和可灌注的血管通道的厚心肌组织的技术，并展示了打印组织构建物在治疗心肌梗塞方面的潜力。
图1 制备dECM纤维和dECM纤维增强生物墨水
将天然心肌脱细胞细胞外基质（dECM）纤维与可光交联的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）混合，获得心肌组织特异性生物墨水，如图1a所示。图1b和1c是对心肌组织进行脱细胞处理并制备生物墨水的过程。具体过程为：取8个月大的家猪心脏，用绞肉机绞碎后，用十二烷基硫酸钠溶液（1 wt%）搅拌心肌组织48h，然后用Triton X-100溶液（1 wt%）处理1h。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗dECM（每8小时一次）3-5天，使用抗生素抗真菌溶液将dECM灭菌24小时，然后用灭菌PBS冲洗3次。最后，将dECM冻干，在无菌条件下使用搅拌机粉碎成微纤维，得到dECM。研究中使用的光交联生物墨水是由3 wt% dECM纤维、5 wt% GelMA、10 wt% PEGDA（Mn=700）和1 wt%光引发剂Irgacure 2959组成的。在进行其他实验之前，将墨水溶液的pH值调节至7.4，并剧烈摇动墨水2h，使微纤维在墨水中完全溶胀并均匀分散。
图2 3D打印具有可灌注血管的厚心肌组织并进行体外表征
图2a说明所设计的各向异性肌纤维和可灌注血管通道来源于心脏的天然组织结构。图2b是使用dECM纤维增强生物墨水3D打印厚心脏组织构件，构件的尺寸约为2cm×2cm，厚度约为5mm，设计了六边形微观结构来模拟天然心肌的纤维取向，图案宽度为200μm，以40%的填充密度打印，相邻层以45°的角度堆叠，此外还设计了直径为1mm可灌注通道，嵌入到打印的构件中。SL打印速度保持在1cm/s，激光强度为20kHz。图2c是打印的构件与人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）、人脐静脉内皮细胞（hECs）和人骨髓间充质干细胞（hMSCs）共培养一周后的图像。如图2d-2f所示，经过7天的共培养，可以观察到hiPSC-CMs聚集成密集的团块结构；同时，hECs在打印的厚构造物顶部的肌纤维内生成了微血管阵列。对心肌收缩蛋白（cTnI）和血管蛋白（vWf）的三维免疫染色研究表明，心肌细胞均匀地分布在3D打印构件的六角形图案纤维上，并带有致密的hEC网络。此外，用免疫染色法在打印的构件上发现了hiPSC-CMs的F-肌动蛋白和α-肌动蛋白表达，CD31染色血管的荧光图像分析显示，打印的大血管通道中hEC粘附密度更高。结果表明，制造出了具有各向异性的肌纤维，同时还生成了可灌注的大血管的构件。
这项研究成功证明了SL打印在制造具有临床相关尺寸的复杂三维仿生分层结构的潜力；提供了一种新颖有效的用于治疗心肌梗死的体外生成仿生心脏组织的方法，为有效修复受损的人体心肌组织和治疗与心肌梗死相关的心血管疾病提供一种解决方法。