供稿人：邱镇南、贺健康 供稿单位：西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室 发布日期：2023-02-16
组织工程肌肉是治疗肌肉缺损的一种正在被广泛研究的方法。通过生物3D打印技术制造组织工程肌肉能够很好的模拟天然骨骼肌的定向束结构。这项工作中，研究者提出将神经细胞与肌细胞混合到同种凝胶中，并通过多材料复合3D打印技术制造骨骼肌支架的方法。研究神经细胞的引入对肌细胞成熟、肌细胞长期存活与功能化生成肌肉-神经连接的作用。
该研究所使用的多材料多细胞复合骨骼肌支架3D打印设备如图1 a所示，该设备具有3个打印喷头，分别填装有细胞水凝胶、生物聚合物PCL和牺牲水凝胶。多材料多细胞复合骨骼肌支架3D打印后结构如图1 b所示，载有肌细胞和神经细胞的水凝胶束与牺牲凝胶束平行相间排布，在凝胶束的两端打印PCL固定结构，以增强支架的结构稳定性。
图1 （a）多材料多细胞复合骨骼肌支架3D打印设备；（b）多材料多细胞复合骨骼肌支架结构示意图；（c）去除牺牲水凝胶后复合骨骼肌示意图具备微流道，运动神经元与肌细胞建立肌肉-神经连接
在打印复合骨骼肌支架前，通过体外培养肌细胞/神经细胞水凝胶并进行肌肉-神经连接功能化表征实验，确定了水凝胶中肌细胞与神经细胞密度比为300：1时能达到最好的功能化效果。如图2所示，使用该细胞比例打印了肌肉/神经细胞复合骨骼肌支架。复合骨骼肌支架在细胞活性和肌功能蛋白表达方面都优于单纯肌细胞的支架。并且复合骨骼肌支架中的肌细胞生成了更多的乙酰胆碱受体结构，同时形成了肌肉-神经连接。
图2 神经元的引入对肌细胞功能化起到了促进作用 (a)复合骨骼肌支架打印路径 (b)复合骨骼肌支架实物图 (c)复合骨骼肌支架凝胶束死活染色结果 (d)骨骼肌支架体外培养1天后的细胞活性统计结果 (e-g) 骨骼肌支架体外培养7天后的MHC染色、肌管长度结果 (h-i)神经细胞体外分化培养染色 (j-l)骨骼肌支架中MHC、肌肉乙酰胆碱受体蛋白和神经丝染色(m)骨骼肌支架中乙酰胆碱受体比例统计结果(n)骨骼肌支架中乙酰胆碱受体和神经丝重贴区域面积占比统计结果
如图3 所示，在大鼠TA肌肉缺损模型动物实验中，肌肉/神经细胞复合骨骼肌支架使得肌缺损得到了更好的恢复。减少了缺损区域纤维蛋白沉积，即缓解了缺损处形成无功能的疤痕，增加了肌肉含量。运动神经元长入情况也得到了改善。
图3 复合骨骼肌支架植入大鼠TA肌肉缺损模型4~8周后的修复效果
总的来说，在组织工程骨骼肌支架中引入神经细胞可以支持肌细胞的长期存活，增强肌源性分化，并诱肌肉-神经连接的形成。在大鼠TA肌肉缺损模型中该支架也促进运动神经元长入并减少了疤痕组织的形成提高了缺损区域功能化骨骼肌的占比。所以该方法是一种能够有效加快骨骼肌缺损功能恢复的方法。