供稿人:周佳佳、王玲 供稿单位：机械制造系统工程国家重点实验室 发布日期：2020-11-24
神经回路的形成和发展在理解大脑机制方面起着关键作用。目前，研究人员已通过各种模型对神经回路进行了广泛研究，如动物模型和2D细胞培养模型，但由于动物与人类的固有差异及2D与3D模型行为的不同，使其应用受到限制。3D细胞打印作为一种新兴的生物制造技术，已经广泛应用于体外组织研究，特别是神经科学中的体外类脑组织构建。
近期，清华大学与美国宾夕法尼亚州德雷塞尔大学研究人员提出了一种利用3D细胞打印技术制造的层状体外类脑组织构建体。该模型基于自然的大脑分层结构，利用简化的三层结构用作神经细胞生长的人工3D环境，每层厚500μm，结构面积8×8 mm2，并具有网格营养支持系统，P01 Wistar大鼠皮质初级神经细胞通过细胞打印系统被引入结构中。为模拟神经细胞周围环境，研究人员选择并测试了由藻酸盐、明胶和纤维蛋白原组成的生物墨水。交联固化后，在样品中加入补充有抑肽酶的新鲜培养基以保持打印结构的稳定性。为提高细胞存活率，对喷嘴尺寸和打印速度进行了参数优化，结果表明，喷嘴内径0.51mm、打印速度5ul·s-1是存活率为85%的优化尺寸。
图1 实验过程的详细说明
打印结构在体外培养4周，活/死细胞检测表明，第0天后，细胞均匀分布在结构内部，存活率在85%左右。在第7～28天，材料和培养基接触的边缘区域逐渐开始降解，但结构弹性模量保持不变。细胞形态由圆形逐渐生长为定向的细胞束，轴突逐渐伸展并构建神经元之间的连接，从而推动神经网络形成。
研究人员发现在长期培养过程中，从第7天开始，3D样品的凋亡率明显低于2D样品。此外，在相同的刺激条件下，3D样品中的峰值为0.6mV，比2D样品大一倍，其归因于3D模型中神经元可以沿z轴方向扩展其生长空间，更多的神经元连接在膜电极组件周围的网络中，产生更大的LFP信号。
此外，根据TTX药物测试，当TTX被添加到培养物中时，可以穿透打印结构并立即影响神经元，EPSP(兴奋性突触后电位)信号显著下降到零，这意味着神经元活动受到TTX的强烈影响。这一结果表明这种打印结构在药物筛选未来应用中的巨大潜力。
图2 (a-c)打印0天后的结构形态; (d-k)体外培养第7～28天打印结构和细胞形态